黃曲霉毒素總量（AFT）ELISA檢測試劑盒

產品詳細描述

【產品介紹】

黃曲霉毒素是一類真菌(如黃曲霉和寄生曲霉)的有毒的代謝產物，它們具有很強的致癌性，主要存在于谷物、堅果、棉籽以及一些和人類血液，動物飼料相關的產品中。薄層色譜一直是檢測黃曲霉毒素常用的方法，但是此方法制備樣品及分析樣品時費時又費力。而使用黃曲霉毒素總量ELISA試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中黃曲霉毒素殘留。

黃曲霉毒素總量(AFT)ELISA檢測試劑盒是應用ELISA技術研發的新一代真菌毒素檢測產品，操作時間35~40min，能最大限度地減少操作誤差和工作強度。

【試驗原理】

黃曲霉毒素總量(AFT)ELISA檢測試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被黃曲霉毒素抗原，樣本中黃曲霉毒素和此抗原競爭黃曲霉毒素的抗體，酶標二抗催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的黃曲霉毒素成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中黃曲霉毒素的含量。

【適用范圍】

黃曲霉毒素總量(AFT)ELISA檢測試劑盒可定性、定量檢測玉米、花生、飼料、食用油等樣本中的黃曲霉毒素。

【交叉反應率】

黃曲霉毒素B2……………………………………………100%

黃曲霉毒素B1…………………………………………97%

黃曲霉毒素G1…………………………………………98%

黃曲霉毒素G2…………………………………………101%

【使用單位需自備的設備及試劑】

設備：

┅┅微孔板酶標儀450nm/630nm

┅┅振蕩器

┅┅渦旋儀

┅┅離心機

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅漏斗

┅┅分液漏斗

┅┅燒杯:50ml

┅┅聚苯乙烯離心管：10ml、50ml

┅┅微量移液器：單道 20l～200l、200l～1000l

多道 250l

┅┅濾紙

試劑：

┅┅甲醇

----去離子水

----石油醚(或正己烷)

【提供的材料與試劑】

組份名稱 96T裝量 48T裝量 備注

酶標板 96T 48T 其它各規格裝量按比例增加或減少，具體裝量以實物為準。

標準品×6瓶* 1ml/瓶 0.5ml/瓶

AFT酶標物 9ml 5ml

AFT抗試劑 6ml 3ml

底物液A液 9ml 5ml

底物液B液 9ml 5ml

終止液 6ml 3ml

濃縮洗滌液(10×) 40ml 20ml

*注：標準品濃度為0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb

【溶液的配制】

配液1: 洗滌工作液

用去離子水將濃縮洗滌液(10×)按1:9體積比進行稀釋，即1份濃縮洗滌液加9份去離子水，用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環境可保存一個月。

配液2: 樣品提取液1

用去離子水將甲醇按3:2體積比進行稀釋，即3份甲醇加2份去離子水，用于提取樣本中的黃曲霉毒素。

配液3: 樣品提取液2

用去離子水將甲醇按7:3體積比進行稀釋，即7份甲醇加3份去離子水，用于提取樣本中的黃曲霉毒素。

【樣本前處理步驟】

(一)花生處理方法

┅┅取10g粉碎樣品，加入30ml樣品提取液1;

┅┅劇烈振蕩5min;

┅┅3500r/min離心5min，或用普通濾紙過濾;

┅┅用去離子水按1:5比例稀釋(1份濾液+5份去離子水);

┅┅取稀釋后液體待測。

稀釋倍數：18

(二)飼料、玉米處理方法

┅┅取3g粉碎樣品，加入15mL樣品提取液2;

┅┅劇烈振蕩10min;

┅┅3500r/min離心5min，或用普通濾紙過濾;

┅┅上清液或濾液用去離子水按1:6比例稀釋(1份濾液+6份去離子水);

┅┅取稀釋后液體待測。

稀釋倍數：35

(三)食用油處理方法

┅┅取5g食用油樣品于小燒杯中;

┅┅用10mL石油醚(或是正己烷)分次將試樣轉移至125mL分液漏斗中;

┅┅準確加入15mL 樣品提取液1，加塞振蕩5分鐘，靜置分層，放出下層甲醇水提取液;

┅┅用去離子水按1:5比例稀釋(1份濾液+5份去離子水);

┅┅取稀釋后液體待測。

稀釋倍數：18

【檢測步驟】

測定前應須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20～25℃)。

2、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。

4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。

5、黃曲霉毒素可致癌，應戴手套操作。

操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫(20～25℃)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放進原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封，保存于2～8℃。不要冷凍。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

5、加標準品/樣本：加標準品/樣本30l到對應的微孔中，再加入黃曲霉毒素總量酶標物70l/孔，最后加入黃曲霉毒素總量抗試劑50l/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光環境中反應30min。

6、洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液300l/孔，充分洗滌5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。

7、顯色：加入底物液A液75l/孔，再加底物液B液75l/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光環境反應15min~20min。

8、測定：加入終止液50l/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止用目測法可進行判定)。

【結果判定】

結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，而定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含黃曲霉毒素成負相關。

1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設樣本1的吸光度值為0.659，樣本2的吸光度值為1.525，標準液吸光度值分別是：0ppb為2.101;0.1ppb為1.738;0.3ppb為1.313;0.9ppb為0.831;2.7ppb為0.469;8.1ppb為0.262。則樣本1的濃度范圍是0.9ppb～2.7ppb;樣本2的濃度范圍是0.1ppb～0.3ppb 再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中黃曲霉毒素的濃度范圍。

2、定量分析

(1)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值(%)= B ×100%/B0

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0(ppb)標準溶液的平均吸光度值

(2)標準曲線的繪制與計算

以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉毒素標準品濃度(ppb)的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲霉毒素實際量。

若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。(歡迎來電索取)

【檢測方法靈敏度、準確度、精密度】

試劑盒靈敏度：0.1ppb

回收率：

花生：95±15%

飼料：85±15%

玉米：90±15%

食用油：95±15%

精密度：

試劑盒的變異系數均小于10%

【注意事項】

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫(20～25℃)會導致所有標準的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。

3、每加一種試劑前需將其搖勻。

4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

6、儲存條件

保存試劑盒于2～8℃，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、試劑變質的跡象

發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5)時，表示試劑可能變質。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色時間為15～20min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到30min(或更長)，但不得超過30min。反之，則減短反應時間。

9、濃縮洗滌液如有結晶屬正?，F象，請加熱溶解后使用。

10、該試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。